Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs): co naprawdę wiemy

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (ang. antimicrobial peptides, AMPs) to krótkie łańcuchy aminokwasowe, zwykle liczące od kilkunastu do kilkudziesięciu reszt, które są kodowane bezpośrednio w genomie i wytwarzane przez komórki gospodarza jako cząsteczki efektorowe odporności wrodzonej. W klasycznym przeglądzie opublikowanym w Nature Michael Zasloff opisał je jako element obrony obecny praktycznie u wszystkich organizmów wielokomórkowych, od roślin i owadów po ssaki. To właśnie ta powszechność w świecie żywym, a nie pojedyncze spektakularne wyniki, jest głównym argumentem za ich znaczeniem biologicznym.

W literaturze coraz częściej używa się szerszego terminu peptydy obronne gospodarza (host defence peptides, HDP) lub kationowe peptydy obronne. Zmiana nazewnictwa nie jest przypadkowa: przegląd opublikowany w Nature Reviews Drug Discovery podkreśla, że wiele z tych cząsteczek w warunkach fizjologicznych działa co najmniej tak samo silnie na układ immunologiczny gospodarza, jak bezpośrednio na drobnoustroje. Nazywanie ich wyłącznie antybiotykami naturalnymi zawęża więc obraz.

Z punktu widzenia chemii fizycznej AMPs łączą dwie cechy. Pierwsza to dodatni ładunek netto, wynikający z nadreprezentacji lizyny i argininy. Druga to amfipatyczność, czyli rozdzielenie reszt hydrofobowych i hydrofilowych na przeciwległe strony cząsteczki po przyjęciu struktury przestrzennej. Pod względem struktury wyróżnia się kilka rodzin:

• peptydy alfa-helikalne, na przykład LL-37 i magaininy;
• peptydy o strukturze beta stabilizowane mostkami dwusiarczkowymi, na przykład defensyny i protegryny;
• peptydy o strukturze wydłużonej, bogate w prolinę, tryptofan lub histydynę, na przykład indolicydyna i histatyny;
• cykliczne lipopeptydy pochodzenia bakteryjnego, na przykład polimyksyny i daptomycyna.

Spektrum działania obejmuje bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne, grzyby, niektóre wirusy osłonkowe oraz pasożyty. Część AMPs wykazuje też aktywność wobec biofilmów, czyli struktur szczególnie trudnych do zwalczenia klasycznymi antybiotykami. Jeżeli potrzebujesz podstaw dotyczących samej chemii peptydów, pomocne będzie omówienie tego, jak działają peptydy.

Ten artykuł ma charakter wyłącznie edukacyjny. Nie zawiera żadnych dawek, schematów stosowania ani zaleceń terapeutycznych i nie zastępuje konsultacji z lekarzem lub farmaceutą.

U człowieka najlepiej scharakteryzowaną grupą są defensyny. Alfa-defensyny gromadzą się w ziarnistościach neutrofilów oraz w komórkach Panetha nabłonka jelita cienkiego, natomiast beta-defensyny są wytwarzane głównie przez nabłonki skóry, dróg oddechowych i układu moczowo-płciowego. Ich wspólną cechą jest zwarta struktura beta usztywniona trzema mostkami dwusiarczkowymi, co zwiększa odporność na degradację enzymatyczną.

Drugą filarową grupą są katelicydyny. U człowieka istnieje tylko jedna katelicydyna, uwalniana z białka prekursorowego hCAP18 w postaci peptydu LL-37, liczącego 37 aminokwasów i rozpoczynającego się od dwóch reszt leucyny. Obszerny przegląd w Cellular Immunology opisuje LL-37 jako cząsteczkę wielofunkcyjną: oprócz działania przeciwbakteryjnego, przeciwgrzybiczego i przeciwwirusowego wykazuje efekty chemotaktyczne, immunomodulujące, prowygajające oraz wpływ na angiogenezę i apoptozę. LL-37 wykrywa się w neutrofilach, keratynocytach, ślinie i wielu innych tkankach. Szczegóły zebrano w osobnym opracowaniu dotyczącym peptydu LL-37.

Na poziomie barier ciała działają kolejne rodziny. W ślinie obecne są histatyny, peptydy bogate w histydynę. Histatyna 5, dwudziestoczteroaminokwasowy fragment histatyny 3 wydzielany przez gruczoły slinowe, jest opisywana jako najsilniejszy przeciwgrzybiczy peptyd śliny, aktywny wobec Candida albicans. W pocie występuje dermcydyna, w wydzielinach śluzowych laktoferyna i uwalniany z niej laktoferycyna, a hepcydyna łączy funkcję przeciwdrobnoustrojową z regulacją metabolizmu żelaza.

Źródła pozaludzkie są jeszcze bardziej różnorodne. Magaininy wyizolowano ze skóry żaby Xenopus laevis i to one zapoczątkowały nowoczesne zainteresowanie tą klasą. Owady wytwarzają cekropiny i drozocyny. Jady zawierają peptydy silnie litycznie czynne, takie jak melityna z jadu pszczoły, których niska selektywność wobec komórek ssaków jest zresztą dobrym przykładem granic tej klasy. Rośliny produkują tioniny, defensyny roślinne i cyklotydy. Bakterie wytwarzają bakteriocyny, w tym nizynę stosowaną jako konserwant żywności, oraz lipopeptydy będące dziś lekami.

Warto odróżnić AMPs od peptydów badanych głównie jako immunomodulatory, bez pierwotnej funkcji litycznej wobec drobnoustrojów. Do tej odrębnej kategorii należą na przykład tripeptyd KPV oraz tymozyna alfa-1. Mechanistycznie to inne zagadnienie i nie należy łączyć danych z obu obszarów.

Punktem wyjścia jest selektywność elektrostatyczna. Powierzchnia bakterii jest silnie ujemnie naładowana: u Gram-ujemnych za sprawą lipopolisacharydu błony zewnętrznej, u Gram-dodatnich za sprawą kwasów lipotejchojowych, a w samej błonie cytoplazmatycznej dzięki fosfatydyloglicerolowi i kardiolipinie. Zewnętrzna warstwa błony komórek ssaków jest natomiast zdominowana przez obojnacze fosfatydylocholinę i sfingomielinę, a dodatkowo wzmocniona cholesterolem. Kationowy peptyd ma więc wbudowaną preferencję wobec celu drobnoustrojowego, choć preferencja ta jest kwestią stopnia, a nie zjawiskiem absolutnym.

Po akumulacji na powierzchni błony peptyd wnika w dwuwarstwę lipidową i zaburza jej organizację. Opisano kilka modeli tego procesu, między innymi model beczki z klepek (barrel-stave), w którym peptydy tworzą uporządkowany kanał wysłany resztami hydrofilowymi, model poru toroidalnego, w którym do wyściółki kanału włączają się także główki lipidów, oraz model dywanu (carpet), w którym gromadzenie peptydu na powierzchni prowadzi do rozpadu błony bez tworzenia zdefiniowanego kanału. W praktyce obraz jest zwykle mieszany i zależy od stosunku peptydu do lipidu oraz od składu błony.

Konsekwencje są szybkie i mało specyficzne: depolaryzacja błony, wyciek jonów i metabolitów, załamanie gradientu protonowego i śmierć komórki w czasie liczonym w minutach. Ta kinetyka jest istotna, ponieważ ogranicza liczbę podziałów komórkowych, w czasie których populacja bakteryjna mogłaby selekcjonować korzystne mutacje.

Dobrze udokumentowanym przykładem zastosowania klinicznego tego mechanizmu jest daptomycyna, cykliczny lipopeptyd wytwarzany przez bakterię glebową Streptomyces roseosporus. Praca przeglądowa w Bioorganic and Medicinal Chemistry wskazuje, że najlepiej scharakteryzowanym efektem daptomycyny jest przepuszczalnienie i depolaryzacja błony bakteryjnej, a nasilenie tego efektu koreluje z zawartością fosfatydyloglicerolu w błonie. Aktywność daptomycyny zależy przy tym od obecności jonów wapnia.

Odmiennie działają polimyksyny. Wiążą się one z częścią lipidu A lipopolisacharydu, destabilizują błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych i dopiero potem docierają do błony wewnętrznej. Dlatego ich spektrum jest zasadniczo ograniczone do Gram-ujemnych, a bakterie Gram-dodatnie, pozbawione błony zewnętrznej i lipidu A, pozostają na nie niewrażliwe.

Nie. Dla części peptydów przerwanie błony jest etapem przejściowym, a nie celem końcowym. Peptydy takie jak buforyny czy niektóre peptydy bogate w prolinę przenikają do wnętrza komórki w stężeniach nieprowadzących do lizy i tam wiążą kwasy nukleinowe, hamują syntezę białka albo blokują aktywność białek opiekuńczych. Inne celują w etapy biosyntezy ściany komórkowej. Nizyna, bakteriocyna stosowana w technologii żywności, wiąże lipid II, prekursor peptydoglikanu, co jednocześnie blokuje budowę ściany i umożliwia tworzenie porów.

Drugą, często niedocenianą warstwą działania jest modulacja odporności. Przegląd w Nature Reviews Drug Discovery opisuje peptydy obronne gospodarza jako cząsteczki kontrolujące zakażenie dwiema drogami: przez bezpośrednie działanie bójcze oraz przez wpływ na odpowiedź immunologiczną. Ten drugi mechanizm obejmuje przyciąganie neutrofilów i monocytów do miejsca zakażenia, wpływ na dojrzewanie komórek dendrytycznych, neutralizację lipopolisacharydu oraz udział w gojeniu ran i angiogenezie. Co istotne dla potencjalnych zastosowań, ta sama praca podkreśla zdolność części peptydów do wygaszania szkodliwego stanu zapalnego, a nie tylko do jego wzmacniania.

Właśnie ta dwoistość czyni interpretację danych trudną. LL-37 opisywano zarówno jako czynnik sprzyjający naprawie tkanek, jako czynnik chemotaktyczny, jak i jako element patogenezy chorób autozapalnych skóry, w których nadmiar katelicydyny współtworzy przewlekłe zapalenie. Przegląd w Cellular Immunology wskazuje dodatkowo na rolę LL-37 w procesach nowotworowych, bez jednoznacznego kierunku efektu. Wniosek praktyczny jest ostrożny: w przypadku AMPs wzrost stężenia peptydu nie jest automatycznie korzystny, a kontekst tkankowy decyduje o znaku efektu.

Dla czytelnika zainteresowanego szerszym tłem immunologicznym punktem wyjścia może być omówienie zależności między peptydami a procesami zapalnymi w artykule o peptydach i stanach zapalnych. Należy jednak pamiętać, że większość tych danych pochodzi z modeli komórkowych i zwierzęcych, a przeniesienie ich na człowieka wymaga badań klinicznych, których w wielu przypadkach wciąż brakuje.

Skala problemu jest dobrze udokumentowana. Systematyczna analiza opublikowana w The Lancet w 2022 roku oszacowała, że w 2019 roku z bakteryjną opornością na antybiotyki wiązało się około 4,95 miliona zgonów, z czego około 1,27 miliona przypisano bezpośrednio tej oporności. Sześć wiodących patogenów, czyli Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii i Pseudomonas aeruginosa, odpowiadało za około 930 000 zgonów przypisanych oporności. Analiza objęła 23 patogeny i 88 kombinacji patogen i lek w 204 krajach oraz terytoriach.

Na tym tle przegląd w The Lancet Infectious Diseases wymienia konkretne przewagi peptydów przeciwdrobnoustrojowych nad klasycznymi antybiotykami: wolniejsze pojawianie się oporności, szerokie działanie wobec biofilmów oraz możliwość korzystnego modulowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Dodatkowym argumentem jest potencjał synergii, czyli obniżania skutecznych stężeń antybiotyków klasycznych w obecności peptydu.

Mechanistyczne uzasadnienie wolniejszej selekcji oporności jest proste. Antybiotyk działający na jedno białko enzymatyczne może stracić skuteczność po jednej mutacji punktowej w genie tego białka. Peptyd działający na fizyczną organizację dwuwarstwy lipidowej wymagałby od bakterii przebudowy składu i ładunku błony, co zwykle wiąże się z kosztem przystosowawczym.

Byłoby jednak błędem przedstawianie AMPs jako klasy wolnej od oporności. Praca w Science poświęcona temu, jak ewolucja powinna kształtować zastosowania peptydów, wprost zwraca uwagę na ryzyko wynikające z wprowadzania do lecznictwa cząsteczek pokrewnych peptydom własnym organizmu, w tym możliwość powstania oporności krzyżowej osłabiającej naszą własną odporność wrodzoną. Praktyka kliniczna potwierdza tę ostrożność. Obszerny przegląd dotyczący kolistyny opisuje opisane mechanizmy oporności, w tym szlaki regulatorowe PhoP i PhoQ oraz PmrA i PmrB u E. coli, K. pneumoniae i P. aeruginosa, mechanizmy wewnętrznej oporności u Acinetobacter, a także mobilne geny oporności na kolistynę z rodziny mcr, zdolne do przenoszenia się między bakteriami na plazmidach.

Właściwa konkluzja jest więc ilościowa, nie jakościowa: oporność na peptydy powstaje zazwyczaj trudniej, ale powstaje.

Wbrew częstemu uproszczeniu, kilka cząsteczek z tej klasy jest od dawna w lecznictwie. Nie są to jednak peptydy ludzkie, lecz lipopeptydy i peptydy pochodzenia bakteryjnego.

Polimyksyny odkryto w latach czterdziestych XX wieku. Jak opisuje przegląd w Emerging Microbes and Infections, z użycia systemowego wycofywano je w kolejnych dekadach z powodu działań niepożądanych, przede wszystkim nefrotoksyczności i neurotoksyczności. Powrót tych leków do praktyki klinicznej wynikał nie z ich poprawionego profilu bezpieczeństwa, lecz z narastania liczby zakażeń wielolekoopornymi bakteriami Gram-ujemnymi przy jednoczesnym ubóstwie nowych opcji. Kolistyna i polimyksyna B weszły do lecznictwa jako te spośród polimyksyn, które uznano za najmniej nefrotoksyczne.

Daptomycyna została wprowadzona do lecznictwa na początku lat dwutysięcznych i jest dziś stosowana w ciężkich zakażeniach wywołanych bakteriami Gram-dodatnimi. Jej mechanizm, zależny od jonów wapnia i od zawartości fosfatydyloglicerolu w błonie, opisano powyżej. Charakterystyczne ograniczenie tej substancji polega na tym, że jest inaktywowana przez surfaktant pęcherzykowy, dlatego nie ma zastosowania w leczeniu zapalenia płuc.

Do grupy antybiotyków o rdzeniu peptydowym należą także glikopeptydy, takie jak wankomycyna i teikoplanina, choć ich mechanizm polega na wiązaniu prekursorów peptydoglikanu, a nie na przerywaniu błony. Wszystkie wymienione substancje są lekami wydawanymi z przepisu lekarza, a większość stosuje się wyłącznie w warunkach szpitalnych, pod kontrolą parametrów nerkowych. Ten artykuł nie podaje i nie może podawać ich dawkowania.

Historia prób wprowadzenia do lecznictwa peptydów wzorowanych na peptydach obronnych gospodarza jest pouczająca, ponieważ składa się głównie z niepowodzeń rejestracyjnych, a nie z braku prób.

Peksyganan (MSI-78) jest analogiem magaininy, przeznaczonym do stosowania miejscowego. W dwóch kolejnych badaniach randomizowanych, podwójnie zaślepionych i kontrolowanych, opublikowanych w Clinical Infectious Diseases, pacjentów z cukrzycą i łagodnie zakażonym owrzodzeniem stopy przydzielano losowo do kremu z peksyganem albo do doustnej ofloksacyny, każdorazowo z odpowiednim placebo dla drugiej drogi podania. Była to zatem próba bezpośredniego porównania leczenia miejscowego peptydem z leczeniem systemowym. Mimo przeprowadzenia tych badań peksyganan nigdy nie uzyskał rejestracji.

Omiganan to syntetyczny, dwunastoaminokwasowy kationowy analog indolicydyny, badany w postaci żelu miejscowego, między innymi w zapobieganiu zakażeniom związanym z cewnikami naczyniowymi oraz w ciężkiej trądzikowatej postaci różowatej. Program objął badania trzeciej fazy, lecz również nie doprowadził do zatwierdzenia leku.

Murepawadyna reprezentuje inne podejście: jest to peptydomimetyk wywodzący się z protegryn, kierowany wybiórczo przeciw Pseudomonas aeruginosa i działający na białko transportu lipopolisacharydu, a nie przez niespecyficzne przerwanie błony. Badania trzeciej fazy w szpitalnym zapaleniu płuc wstrzymano, a następnie przerwano, po stwierdzeniu wyższej niż oczekiwano częstości ostrego uszkodzenia nerek w grupie otrzymującej lek. Przypadek ten dobrze ilustruje, że nawet wysoka selektywność wobec patogenu nie gwarantuje bezpieczeństwa narządowego.

Istnieją też badania z użyciem samego peptydu ludzkiego. W randomizowanym, podwójnie zaślepionym badaniu kontrolowanym placebo, opublikowanym w Archives of Dermatological Research, oceniano krem z LL-37 stosowany miejscowo przez cztery tygodnie u pacjentów z łagodnie zakażonym owrzodzeniem stopy cukrzycowej. Wzrost wskaźnika ziarninowania był konsekwentnie większy w grupie LL-37 w dniach 7, 14, 21 i 28 (odpowiednio p = 0,031, 0,009, 0,006 i 0,037). Autorzy stwierdzili jednocześnie, że krem nie obniżył stężeń IL-1 alfa ani TNF alfa i nie zmniejszył liczby kolonizujących bakterii tlenowych. To użyteczny przykład wyniku częściowo pozytywnego, którego nie należy nadinterpretować: dotyczy jednego wskazania, jednej postaci miejscowej i jednego ośrodka.

Podsumowując obecny stan: żaden nowy, systemowo podawany peptyd tej klasy nie jest zarejestrowanym lekiem, a wszystkie wymienione cząsteczki pozostają substancjami badanymi.

Przegląd w The Lancet Infectious Diseases formułuje to wprost: ograniczenia strukturalne i funkcjonalne, w połączeniu z surowszym otoczeniem regulacyjnym, utrudniły translację kliniczną peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Warto rozłożyć ten wniosek na składniki.

Selektywność i toksyczność. Preferencja kationowego peptydu wobec ujemnie naładowanych błon bakteryjnych jest statystyczna, nie absolutna. W wyższych stężeniach wiele AMPs uszkadza także błony komórek gospodarza, co w testach in vitro objawia się hemolizą. Okno między stężeniem bójczym dla drobnoustroju a stężeniem toksycznym dla gospodarza bywa wąskie. Przykładem skrajnym są peptydy jadów, takie jak melityna, których działanie lityczne jest w praktyce nieselektywne. W warunkach klinicznych problemem bywa toksyczność narządowa, przede wszystkim nerkowa, co widać zarówno w profilu polimyksyn, jak i w przerwanych badaniach murepawadyny.

Stabilność. Peptydy są naturalnym substratem proteaz. Ich okres półtrwania w krążeniu bez modyfikacji chemicznych jest zazwyczaj krótki, a aktywność przeciwdrobnoustrojowa dodatkowo słabnie w obecności soli fizjologicznych, kationów dwuwartościowych i białek surowicy. Dobrze opisanym przykładem jest histatyna 5, która w warunkach in vitro działa w stężeniu fizjologicznym, lecz w jamie ustnej jej aktywność jest osłabiana przez interakcje z solami, metalami, proteazami i innymi białkami śliny. Dodatkowo proteazy aspartylowe Candida albicans potrafią degradować ten peptyd, co pokazuje, że drobnoustroje aktywnie przeciwdziałają peptydom gospodarza.

Koszt i wytwarzanie. Synteza peptydów na fazie stałej jest bardziej kosztowna niż produkcja typowych małych cząsteczek, a koszt rośnie z długością łańcucha i z liczbą modyfikacji. Dla leku przeciwzakaźnego, który musi konkurować cenowo z generycznymi antybiotykami o ugruntowanej pozycji, jest to bariera ekonomiczna, nie tylko techniczna.

Odpowiedzią na te trudności są strategie inżynierii molekularnej: wprowadzanie aminokwasów D, cyklizacja, lipidacja, pegylacja, skracanie do minimalnych aktywnych fragmentów, konstruowanie peptydomimetyków o szkielecie niepeptydowym oraz nośniki umożliwiające podanie miejscowe. Przegląd w The Lancet Infectious Diseases zwraca też uwagę na rolę narzędzi obliczeniowych i eksperymentalnych w przyspieszaniu rozwoju przedklinicznego i klinicznego tej klasy cząsteczek. Są to kierunki obiecujące, ale nie zmieniają obecnego stanu rejestracyjnego.

Rozróżnienie statusu poszczególnych substancji jest tu kluczowe i bywa źródłem nieporozumień. Kolistyna, polimyksyna B i daptomycyna są lekami: mają ustaloną charakterystykę produktu leczniczego, zarejestrowane wskazania, znane przeciwwskazania i wymagają nadzoru lekarskiego, w tym monitorowania funkcji nerek. Peksyganan, omiganan, murepawadyna, LL-37 w postaciach badawczych i zdecydowana większość pozostałych peptydów z tej klasy nie są zatwierdzone jako leki ani przez FDA, ani przez EMA. W obrocie poza kanałem aptecznym występują one zwykle z adnotacją o przeznaczeniu wyłącznie do celów badawczych, co oznacza brak oceny bezpieczeństwa dla ludzi oraz brak gwarancji tożsamości, czystości i jałowości preparatu.

Status prawny peptydów badawczych różni się między jurysdykcjami i zmienia się w czasie. W wielu krajach ich sprzedaż z przeznaczeniem do stosowania u ludzi jest niedozwolona, a obecność peptydu w ofercie sprzedawcy nie jest żadnym dowodem na jego dopuszczenie. Odrębną kwestią jest sport wyczynowy, gdzie część peptydów podlega regulacjom antydopingowym.

Z perspektywy czytelnika praktyczny wniosek jest prosty. Zakażenie bakteryjne, w szczególności podejrzenie zakażenia wielolekoopornego, jest sytuacją wymagającą diagnostyki mikrobiologicznej i leczenia prowadzonego przez lekarza, z doborem leku na podstawie antybiogramu. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe są fascynującym obszarem badań, ale nie są dostępną domowo alternatywą dla antybiotykoterapii, a samodzielne eksperymentowanie z nimi niesie realne ryzyko, w tym ryzyko opóźnienia skutecznego leczenia.

Zastrzeżenie medyczne. Ten artykuł ma charakter wyłącznie edukacyjny i nie stanowi porady medycznej. Nie zawiera dawek, schematów stosowania ani zaleceń dotyczących samodzielnego stosowania jakiejkolwiek substancji. Większość omówionych peptydów nie jest zatwierdzona do stosowania u ludzi, a znaczna część przedstawionych danych pochodzi z badań przedklinicznych, których wyniki nie przenoszą się automatycznie na człowieka. W przypadku jakichkolwiek objawów zakażenia lub pytań dotyczących leczenia należy skonsultować się z lekarzem lub farmaceutą.