Антимикробные пептиды: справочный обзор механизмов, источников и клинического статуса

Антимикробные пептиды (АМП, англ. antimicrobial peptides, AMPs), которые в современной литературе всё чаще называют пептидами врождённой защиты (host defence peptides), это короткие последовательности аминокислот, участвующие в противомикробной обороне организма. Типичная длина составляет от 10 до 60 остатков, суммарный заряд у большинства представителей положительный, а пространственная организация амфипатическая: гидрофобные и заряженные остатки разнесены по противоположным сторонам молекулы. Именно эта геометрия позволяет пептиду одновременно удерживаться на отрицательно заряженной поверхности микробной мембраны и погружаться в её липидное ядро.

Принципиальное отличие от большинства классических антибиотиков лежит в логике действия. Малые молекулы вроде бета-лактамов, фторхинолонов или макролидов связываются с конкретной белковой мишенью: пенициллин-связывающим белком, топоизомеразой, рибосомой. Точечная мишень означает, что одной мутации иногда достаточно для потери чувствительности. Многие АМП, напротив, действуют на мембрану как на физическую систему, и их эффективность определяется составом липидов, а не последовательностью одного гена. В обзоре Zasloff в Nature (2002) этот подход описан как эволюционно древняя стратегия, сохранившаяся у растений, насекомых, амфибий, рыб и млекопитающих.

Важно сразу развести два понятия, которые в популярных текстах часто смешивают. Существуют пептиды врождённого иммунитета человека и животных (дефензины, кателицидины, гистатины) и существуют пептидные антибиотики микробного происхождения (полимиксины, бацитрацин, даптомицин, нисин). Вторая группа давно присутствует в медицине и в пищевой промышленности, первая в основном остаётся объектом исследований. Это разделение определяет и регуляторный статус, и доступность данных по безопасности.

Масштаб класса хорошо виден по специализированным базам данных. В публикации, описывающей базу APD3 (Nucleic Acids Research, 2016), на момент выхода статьи было собрано 2 619 антимикробных пептидов, в том числе 1 972 пептида врождённой защиты животных, 321 пептид растений и 261 бактериоцин бактериального происхождения. С тех пор число описанных последовательностей продолжало расти. Если базовая биохимия пептидов для вас новая тема, полезно начать с материала о том, как вообще работают пептиды.

У человека лучше всего изучены две больших семьи. Дефензины это компактные пептиды, стабилизированные тремя дисульфидными мостиками. Альфа-дефензины нейтрофилов (HNP1 до HNP4) хранятся в азурофильных гранулах и высвобождаются при фагоцитозе, а дефензины HD5 и HD6 вырабатываются клетками Панета в криптах тонкой кишки. Бета-дефензины экспрессируются эпителием кожи, дыхательных и мочеполовых путей. Обзор Ganz в Nature Reviews Immunology (2003) описывает их как вклад в антимикробную активность гранулоцитов и в барьерную защиту слизистых и кожи.

Кателицидины у человека представлены единственным членом: пептидом LL-37, который отщепляется протеазами от предшественника hCAP-18 (ген CAMP). Название отражает структуру: 37 остатков, начинающихся с двух лейцинов. LL-37 обнаруживается в нейтрофилах, в кератиноцитах, в эпителии и в биологических жидкостях, а его экспрессия регулируется в том числе сигналами витамина D. Обзор Vandamme и соавторов в Cellular Immunology (2012) описывает LL-37 как пептид с антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью, а также с хемотаксическими, иммуностимулирующими и проангиогенными свойствами. Подробный разбор этой молекулы собран в отдельном справочнике по LL-37.

Третья группа, значимая для человека, это гистатины: богатые гистидином катионные пептиды слюны. Гистатин 5 считается наиболее активным противогрибковым представителем семейства и рассматривается как элемент защиты полости рта от Candida albicans. Миниобзор Puri и Edgerton в Eukaryotic Cell (2014) подчёркивает, что для гистатина 5 образование пор в мембране в значительной степени опровергнуто: пептид связывается с белками и гликанами клеточной стенки гриба, поступает внутрь через транспортёры полиаминов и действует на внутриклеточные цели.

За пределами человека источники ещё разнообразнее. Из кожи шпорцевой лягушки Xenopus laevis были выделены магаинины, ставшие прототипом для синтетических аналогов. Яды содержат мембранолитические пептиды: мелиттин у пчелы, мастопараны у осиных. Растения производят тионины, растительные дефензины и циклотиды, грибы дают плектазин, а бактерии синтезируют бактериоцины, среди которых наиболее известен нисин. Для материалов о наружной и барьерной биологии кожи полезен также контекст пептидов с противовоспалительным профилем, например трипептида KPV.

Первый этап почти всегда электростатический. Наружная поверхность бактерий несёт выраженный отрицательный заряд: у грамотрицательных это липополисахарид внешней мембраны, у грамположительных тейхоевые и липотейхоевые кислоты, а цитоплазматическая мембрана богата анионными фосфолипидами, прежде всего фосфатидилглицерином и кардиолипином. Катионный пептид концентрируется на такой поверхности, после чего его гидрофобная сторона внедряется в липидный бислой.

Дальнейшие события описываются несколькими моделями, которые не исключают друг друга. В модели бочки из клёпок (barrel-stave) молекулы пептида выстраиваются перпендикулярно плоскости мембраны и образуют канал, стенки которого состоят только из пептида. В модели тороидальной поры пептид втягивает в пору полярные головки липидов, и стенка канала оказывается смешанной, липидно-пептидной. В ковровой модели (carpet) пептид накапливается на поверхности, достигает критической концентрации и дезинтегрирует бислой без формирования дискретного канала. Обзор Hancock и Sahl в Nature Biotechnology (2006) рассматривает эти механизмы как спектр, а не как взаимоисключающие сценарии.

Избирательность в отношении микроба, а не клетки хозяина, объясняется различием липидных составов. Наружный слой мембраны клеток млекопитающих преимущественно нейтрален и образован фосфатидилхолином и сфингомиелином, а присутствие холестерина повышает плотность упаковки и снижает чувствительность к внедрению пептида. Эта разница реальна, но не абсолютна: при повышении концентрации многие АМП проявляют гемолитическую и цитотоксическую активность, и именно это ограничивает их системное применение.

Практически важное следствие мембранного механизма состоит в скорости и в независимости от метаболической активности. Пептиды, действующие на мембрану, способны поражать клетки в состоянии покоя и персистеры, а также проникать в биоплёнки, где классические антибиотики, нацеленные на рост и деление, теряют эффективность. Обзор Magana и соавторов в The Lancet Infectious Diseases (2020) относит антибиоплёночную активность широкого спектра к числу основных заявленных преимуществ этого класса.

Представление об АМП как исключительно о мембранных детергентах устарело. Для значительной части пептидов повреждение мембраны является либо способом проникновения, либо лишь одним из нескольких параллельных эффектов. Hancock и Sahl (2006) описывают пептиды, которые при субингибирующих концентрациях не разрушают бислой, но накапливаются в цитоплазме и нарушают внутриклеточные процессы.

Наиболее хорошо охарактеризованная внутриклеточная мишень это липид II, мембранный предшественник пептидогликана. Бактериоцин нисин и грибной дефензин плектазин связывают липид II и блокируют сборку клеточной стенки. Такая мишень привлекательна тем, что она не белковая, а строго бактериальная: её нет в клетках человека, и её структура консервативна.

Другие описанные направления включают связывание нуклеиновых кислот и подавление транскрипции и трансляции, взаимодействие с бактериальными шаперонами и белками теплового шока, нарушение работы ферментов клеточного деления, а также индукцию стрессовых ответов и накопления активных форм кислорода. Для гистатина 5 в обзоре Puri и Edgerton (2014) описана последовательность событий, в которой мишени находятся внутри клетки гриба: пептид влияет на функции митохондрий и вызывает оксидативный стресс, однако непосредственной причиной гибели называют нарушение регуляции объёма клетки и ионный дисбаланс на фоне осмотического стресса.

Клиническое значение такой многоцелевой природы двойственное. С одной стороны, несколько параллельных мишеней затрудняют формирование устойчивости одним мутационным шагом. С другой стороны, многоцелевое действие усложняет и доклиническую разработку: труднее определить фармакодинамический маркер, труднее предсказать взаимодействия и труднее отделить антимикробный эффект от воздействия на клетки хозяина.

Переименование класса из антимикробных пептидов в пептиды врождённой защиты произошло не случайно. Обзор Mookherjee и соавторов в Nature Reviews Drug Discovery (2020) формулирует это прямо: катионные пептиды врождённой защиты контролируют инфекции как за счёт прямого микробицидного действия, так и за счёт модуляции иммунного ответа хозяина, а отдельные пептиды способны разрешать избыточное воспаление.

Для LL-37 описан широкий набор таких функций. Обзор Vandamme и соавторов (2012) перечисляет хемотаксическую активность в отношении нейтрофилов, моноцитов и Т-лимфоцитов, участие в заживлении ран, в ангиогенезе и в регуляции апоптоза. Отдельное значение имеет способность связывать и нейтрализовать липополисахарид: это снижает активацию TLR4 и может ослаблять эндотоксин-индуцированный воспалительный каскад, что важно в контексте тяжёлых грамотрицательных инфекций.

Существенно, что in vivo концентрации многих АМП в тканях часто ниже тех, при которых в пробирке наблюдается прямое уничтожение бактерий, а физиологические концентрации солей, присутствие сыворотки и связывание с белками дополнительно снижают микробицидную активность. Это один из аргументов в пользу того, что в организме иммуномодулирующая роль может быть не менее значимой, чем прямое киллинг-действие.

Обратная сторона иммуномодуляции это потенциальный вклад в патологию. Повышенная экспрессия и накопление LL-37 обсуждаются в связи с псориазом и розацеа, где пептид рассматривается как участник поддержания хронического воспаления, а в части работ и как потенциальный аутоантиген. Поэтому модель больше пептида значит лучше защита к АМП не применима. Для более широкого обзора пептидов, исследуемых в контексте воспаления, можно посмотреть материал о пептидах и воспалительных процессах, а также справочник по тимозину альфа-1 как примеру иммуномодулирующего пептида с иной биологией.

Масштаб проблемы задан эпидемиологическими оценками. В систематическом анализе Antimicrobial Resistance Collaborators, опубликованном в The Lancet (2022), для 2019 года оценено 4,95 млн смертей, связанных с бактериальной антимикробной резистентностью, и 1,27 млн смертей, напрямую ей приписанных. В анализ вошли 23 патогена и 88 комбинаций патоген и препарат в 204 странах и территориях. Шестью ведущими патогенами по числу смертей, связанных с резистентностью, названы Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa.

На этом фоне АМП выглядят привлекательным направлением по нескольким причинам, которые Magana и соавторы (2020) перечисляют как заявленные преимущества класса: более медленное появление устойчивости, антибиоплёночная активность широкого спектра и способность благоприятно модулировать иммунный ответ хозяина. Логика понятна: трудно мутационно изменить липидный состав собственной мембраны так, чтобы она перестала быть анионной, не заплатив за это приспособленностью.

Однако формулировка медленнее не равна формулировке невозможно. Устойчивость к катионным пептидам описана и хорошо изучена. У Staphylococcus aureus фермент MprF лизинилирует фосфатидилглицерин и снижает отрицательный заряд мембраны. У грамотрицательных бактерий двухкомпонентные системы PhoPQ и PmrAB модифицируют липид A липополисахарида, уменьшая его сродство к катионным пептидам. Отдельную тревогу вызвал плазмидный ген mcr-1, обеспечивающий передаваемую устойчивость к колистину. Кроме того, бактерии секретируют протеазы, разрушающие пептиды, и используют системы выведения.

Из этого следует важное для общественного здоровья предостережение, которое подчёркивается в обзорной литературе: широкое терапевтическое использование молекул, близких к собственным пептидам врождённого иммунитета человека, может способствовать отбору штаммов, устойчивых одновременно и к препарату, и к естественным защитным механизмам хозяина. Этот риск кросс-резистентности остаётся одним из серьёзных аргументов в пользу осторожной разработки.

Вопреки распространённому впечатлению, пептидные противомикробные средства в медицине не новость. Одобренные представители этого класса существуют десятилетиями, но почти все они имеют микробное, а не человеческое происхождение и были получены из продуктов бактериального или грибного метаболизма.

Полимиксины показательны именно как иллюстрация компромисса. Обзор Velkov и соавторов в Future Microbiology (2013) рассматривает колистин и полимиксин B как всё чаще применяемые препараты последней линии при инфекциях, вызванных мультирезистентными грамотрицательными бактериями. Причина, по которой их на десятилетия вытеснили из практики, это дозолимитирующая нефротоксичность и нейротоксичность, а возвращение связано именно с дефицитом альтернатив.

Даптомицин демонстрирует другую сторону вопроса. Этот циклический липопептид был описан в 1987 году и вышел на рынок в 2003 году, однако его точный механизм действия обсуждается до сих пор. Обзор Gray и Wenzel в журнале Antibiotics (2020) описывает дискуссию вокруг деполяризации цитоплазматической мембраны, возможного образования крупных пор и выявленной позднее способности подавлять синтез клеточной стенки через взаимодействие с предшественниками. Активность даптомицина зависит от ионов кальция и от присутствия бактериального фосфатидилглицерина, что и обеспечивает избирательность в отношении грамположительных бактерий.

Ключевой вывод этого раздела: ни один из человеческих пептидов врождённой защиты, включая LL-37 и дефензины, не является одобренным лекарственным средством. Утверждения обратного следует считать некорректными.

История клинической разработки АМП показательна и в целом отрезвляюща. Наиболее задокументированный пример это пексиганан (MSI-78), синтетический аналог магаинина, который разрабатывался в виде крема для лечения инфицированных диабетических язв стопы. В публикации Lipsky, Holroyd и Zasloff в Clinical Infectious Diseases (2008) описаны два последовательных двойных слепых контролируемых исследования, в которых пациентов с умеренно инфицированными диабетическими язвами стопы рандомизировали на крем с пексигананом или на пероральный офлоксацин. Всего рандомизировали 835 пациентов. Одно из двух исследований не продемонстрировало эквивалентности, тогда как второе исследование и объединённые данные показали сопоставимые результаты: частота клинического улучшения от 85 до 90 процентов, общая частота микробиологической эрадикации от 42 до 47 процентов, сходная частота заживления раны. Частота нарастания целлюлита составляла от 2 до 4 процентов, частота ампутаций от 2 до 3 процентов, и между группами эти показатели значимо не различались.

Несмотря на эти данные, пексиганан не получил одобрения регуляторов, и дальнейшая программа его клинической разработки была прекращена. Эта траектория типична: за последние три десятилетия в клинические исследования вошли десятки пептидных кандидатов, а до регистрации дошли единицы.

В обзорах Mookherjee и соавторов (2020) и Magana и соавторов (2020) описаны и другие направления. Среди них местные препараты на основе катионных пептидов для кожных и слизистых показаний, производные протегрина для лечения госпитальных грамотрицательных инфекций, синтетические миметики дефензинов и пептидомиметики, а также попытки использовать иммуномодулирующие свойства пептидов вне инфекционного контекста, например при хронических воспалительных заболеваниях и в заживлении ран. Отдельно отмечается, что разработка одного из системных кандидатов, производного протегрина мурепавадина, была приостановлена на этапе исследований III фазы из-за сигналов нефротоксичности.

Общая закономерность читается отчётливо: кандидаты чаще достигают успеха в местных и наружных формах, где высокую локальную концентрацию можно создать без системной экспозиции, и чаще терпят неудачу при системном введении. Там, где конечной точкой является превосходство над активным контролем или над плацебо, большинство исследований не достигают заявленных целей.

Magana и соавторы (2020) формулируют причину разрыва между лабораторным потенциалом и клинической реальностью сжато: структурные и функциональные ограничения в сочетании с более строгой регуляторной средой затормозили клиническую трансляцию антимикробных пептидов как потенциальных терапевтических агентов. Эти ограничения стоит разобрать по отдельности.

Токсичность и узкое терапевтическое окно. Избирательность в отношении микробных мембран относительна. Разница между концентрацией, подавляющей рост бактерий, и концентрацией, вызывающей гемолиз или повреждение клеток хозяина, у многих природных пептидов невелика. Для полимиксинов эта проблема выражена в виде нефротоксичности и нейротоксичности, ограничивающих дозу.

Метаболическая нестабильность. Пептиды являются субстратом для многочисленных протеаз плазмы, тканей и самих микробов. Без химической модификации период полувыведения часто измеряется минутами, а пероральное применение практически невозможно из-за разрушения в желудочно-кишечном тракте.

Зависимость от среды. Активность катионных пептидов в значительной степени снижается при физиологической ионной силе, в присутствии двухвалентных катионов, сыворотки, полианионов и гнойного экссудата. Это одна из причин, по которым впечатляющие значения минимальной подавляющей концентрации в простых средах плохо переносятся на условия инфицированной ткани.

Стоимость и производство. Твердофазный синтез длинных пептидов остаётся дорогим, а стоимость курса лечения для препарата, который должен конкурировать с дешёвыми генериками, становится самостоятельным барьером. Биотехнологическая экспрессия осложняется тем, что продукт токсичен для клетки-продуцента.

Направления, которыми пытаются отвечать на эти ограничения, включают введение D-аминокислот и неприродных остатков, циклизацию, липидирование, укорочение до минимального активного фрагмента, создание пептидомиметиков, доставку в составе наночастиц и гидрогелей, а также применение вычислительных методов и машинного обучения для дизайна последовательностей с лучшим индексом селективности.

Отдельные антимикробные пептиды, прежде всего LL-37, широко обсуждаются за пределами академической литературы и предлагаются как исследовательские соединения. Здесь необходима полная ясность в терминах. LL-37 и другие человеческие пептиды врождённой защиты не являются одобренными лекарственными препаратами ни в США, ни в Европейском союзе, ни в других крупных юрисдикциях. Они не имеют утверждённых показаний, утверждённых режимов применения и полного набора данных по безопасности у человека.

Юридический статус таких соединений различается от страны к стране и может меняться. В большинстве случаев они классифицируются как материалы для исследовательского использования и не предназначены для введения человеку. Приобретение, хранение и использование регулируются местным законодательством, за соблюдение которого отвечает сам пользователь.

Важно также помнить о различии уровней доказательности. Данные, полученные в пробирке на культуре бактерий, не эквивалентны данным на животных моделях, а данные на животных не эквивалентны результатам контролируемых клинических исследований у человека. Для большинства АМП доступны именно первые два уровня, и именно на этом этапе неоднократно обрывались программы разработки, выглядевшие убедительно доклинически.

Медицинский дисклеймер. Этот материал подготовлен исключительно в образовательных целях и не является медицинской консультацией. Он намеренно не содержит дозировок, схем применения, протоколов или рекомендаций по самостоятельному использованию каких-либо соединений. Инфекционные заболевания требуют точной диагностики и назначения терапии квалифицированным врачом, а самостоятельное применение противомикробных средств способствует развитию резистентности и может нанести прямой вред. Перед любыми решениями, касающимися здоровья, обратитесь к лечащему врачу или другому квалифицированному специалисту здравоохранения.